İnsan beyni-damarı, sinir sağlamlığının kritik, lakin tarixi olaraq az öyrənilən bir hissəsidir. Beyin damarlarını təşkil edən müxtəlif endotel, divar və perivaskular hüceyrələrinin pozulması stroke-dən Alçaymer xəstəliyinə qədər xəstəliklərin mərkəzindədir. Bununla birlikdə, bu hüceyrə populyasiyasını molekulyar səviyyədə xarakterizə etmək müstəsna çətinliklər yaradır. Güclü bir bodrum membranında yerləşən damar hüceyrələri standart disoziasiya metodlarına qarşı dayanır və mövcud bir nüvəli genomik atlaslarda sistematik tükənməsinə və az təmsil olunmasına səbəb olur. Bu, neyrologiya sahəsində böyük kör nöqtə yaratdı. Bu maneəni aradan qaldırmaq üçün, biz vərəqlərin izolyasiyasını və nüvə çıxarmasını (VINE-seq) və onun inkişaf etmiş təkrarlamasını, MultiVINE-seq inkişaf etdirdik. Protokol, insan və siçan beyninin təzə və ya dondurulmuş toxumalarından damar, perivaskular və immun hüceyrələrinin zənginləşdirilməsi və yüksək qətnamə ilə profilləşdirilməsi üçün güclü, təkrarlana bilən iş axını təmin edir. Birincisi, toxunulmayan damarlar (əsasən, kapilyarlar və kiçik arteriolar / venullar, diametri 100 μm) dextran əsaslı sıxlıq gradient mərkəzləşdirilməsi vasitəsilə homogenləşdirilmiş beyin toxumasından ayrılır, damar pelletini mielin və parenkimal fraksiyadan ayırır. İkincisi, toplanan su qabları tutulan çirklənmələri aradan qaldırmaq üçün hüceyrə çirklənmə cihazının üstünə ciddi şəkildə yuyulur. Üçüncü mərhələdə kritik yenilik var: fermentli həzmlə təmizlənmiş su damarlarından nüvələrin optimallaşdırılmış çıxarılması. Çıxışdan sonra protokol geniş istifadə olunan damla əsaslı sıralama platformaları üçün uyğun olan yüksək təmizlik nüvələrinin toplanmasını təmin etmək üçün fluoresans aktivləşdirilmiş hüceyrə sıralamasını (FACS) istifadə edir (məsələn, 10x Genomics tək hüceyrə 3′ və ya multiom). Bu protokol 45 saat tələb edir və tək hüceyrə və axın sitometri təlimləri ilə tədqiqatçılar tərəfindən həyata keçirilə bilər.
Təzə və ya dondurulmuş insan və ya siçan beyin toxumu homogenize edilir və toxunulmayan damarlar sıxlıq sentrifüqasiyası vasitəsilə təcrid edilir. Vaskular nüvələr kollagenaz III həzmindən istifadə edərək yuyulmuş damarlardan enzimatik olaraq çıxarılır.
Paralel olaraq, parenkimal nüvələr sıxlıq gradiyentindən bərpa edilir. Həm damar və həm də parenkimal nüvələr FACS ilə təmizlənir, bu da yüksək təmizlik və tək nüvəli RNA sekvensiyası (snRNA-seq), transpozasa əlçatan xromatin üçün tək nüvəli test (snATAC-seq) və çox atom iş axınları ilə uyğunluğu təmin edir.
Bu abunə məzmununun əvvəlcədən görünüşüdür, sizin müəssisənizdən istifadə etmək üçün.
Access Nature və 54 digər Nature Portfoli jurnalları
Nature+ -ni əldə edin, ən yaxşı qiymətli onlayn giriş abunəçiliyimiz
Xülasə — davamını mənbədə oxuyun.
